哪些器械和化妝品應(yīng)該做透皮吸收試驗(yàn)？如何做？依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)有哪些？
南京西格瑪醫(yī)學(xué)
透皮吸收試驗(yàn)是化妝品安全評(píng)估中的毒理試驗(yàn)之一。我國(guó)官方有關(guān)化妝品透皮吸收試驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定或資料幾乎為空白，然而很多企業(yè)在化妝品研發(fā)時(shí)，透皮吸收試驗(yàn)可能又是化妝品安全性評(píng)價(jià)程序需要進(jìn)行的第一階段試驗(yàn)。
道理也很簡(jiǎn)單，化妝品必須經(jīng)皮吸收以后才能發(fā)揮其功效作用，但是化妝品區(qū)別于藥物，它的功效成分的透皮吸收不需要透過(guò)皮膚進(jìn)入人體循環(huán)，只需要作用于皮膚表面或者是進(jìn)入皮膚的表皮、真皮等不同皮膚層，之后在其部位積聚并發(fā)揮有效作用即可。所以如何保證化妝品皮膚吸收的安全定性或定量，也是做透皮吸收試驗(yàn)的意義所在。
如果你是化妝品研發(fā)企業(yè)，在化妝品備案或注冊(cè)過(guò)程中，毒理學(xué)試驗(yàn)是必須提交的資料之一。但是哪些化妝品應(yīng)該做透皮吸收試驗(yàn)？如何做？依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)有哪些？相信都是很多化妝品公司疑惑的地方。
透皮吸收試驗(yàn)有兩大類一類是體外試驗(yàn)，一類體內(nèi)試驗(yàn)，在官方資料不完善的情況下，如何選擇官方認(rèn)可的透皮吸收試驗(yàn)就成為企業(yè)急需了解的問題。大家也了解，化妝品安全檢測(cè)報(bào)告必須要有理有據(jù)，即便沒有針對(duì)性標(biāo)準(zhǔn)，參考相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)也是可以的，那么透皮吸收試驗(yàn)應(yīng)該依據(jù)哪個(gè)標(biāo)準(zhǔn)來(lái)做呢？下面我們就這些關(guān)鍵問題，為大家介紹一下。
哪些化妝品應(yīng)該做透皮吸收試驗(yàn)？
這個(gè)問題的答案，其實(shí)在官方文件中還真有提到，不過(guò)只是“藏的有點(diǎn)深”。我們可以翻看，在最新的《化妝品安全評(píng)估技術(shù)導(dǎo)則（2021年版）》第五章節(jié)“毒理學(xué)研究”第11小節(jié)中，對(duì)“透皮吸收”做了明確說(shuō)明，所以化妝品完全可以參考該章節(jié)的規(guī)定做透皮吸收試驗(yàn)。具體規(guī)定如下：
1.無(wú)原料和/或風(fēng)險(xiǎn)物質(zhì)的透皮吸收試驗(yàn)，可采用國(guó)際通用的透皮吸收試驗(yàn)方法獲取相應(yīng)的數(shù)據(jù)。在透皮吸收數(shù)據(jù)時(shí)，吸收率以100%計(jì)；
2.若滿足以下部分條件：分子量﹥500道爾頓，高度電離，脂水分配系數(shù)Log Pow≤-1或≥4，拓?fù)錁O性表面積>120?2，熔點(diǎn)>200℃，吸收率以10%計(jì)；
3.若化學(xué)合成的由一種或一種以上結(jié)構(gòu)單元，通過(guò)共價(jià)鍵鏈接，平均相對(duì)分子質(zhì)量大于1000道爾頓，且相對(duì)分子質(zhì)量小于1000道爾頓的低聚體含量少于10%，結(jié)構(gòu)和性質(zhì)穩(wěn)定的聚合物（具有較高生物活性的原料除外），可不考慮透皮吸收。
4.吸收率不以100%計(jì)時(shí)，需提供有關(guān)情況說(shuō)明。
總結(jié)來(lái)講，功效宣稱有保濕、美白、延緩衰老等的化妝品，需要建立在透皮吸收試驗(yàn)的基礎(chǔ)上開展安全性評(píng)價(jià)程序。
做化妝品透皮吸收試驗(yàn)應(yīng)該依據(jù)哪些標(biāo)準(zhǔn)？
化妝品透皮吸收試驗(yàn)分為體內(nèi)試驗(yàn)和體外試驗(yàn)。體內(nèi)試驗(yàn)一般是指通過(guò)測(cè)量化合物經(jīng)尿液和排泄物排出體外的量來(lái)反映經(jīng)皮吸收量。
但是，實(shí)際操作中，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)受到許多因素的制約，如檢
測(cè)方法的敏感度、倫理約束、化合物及其代謝產(chǎn)物的排出速率、個(gè)體差異等。因此，對(duì)于化妝品成份來(lái)說(shuō)，體內(nèi)試驗(yàn)沒有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。
除非在必要時(shí)，如用于體內(nèi)與體外方法的對(duì)比、特殊活性物質(zhì)皮膚吸收的確認(rèn)，可采用無(wú)毛的裸鼠進(jìn)行體內(nèi)研究。體內(nèi)試驗(yàn)可參考GB/T 27825-2011 《化學(xué)品 皮膚吸收 體內(nèi)試驗(yàn)方法》。
體外試驗(yàn)是化妝品透皮吸收試驗(yàn)的主流方法。檢測(cè)方法主要有體外擴(kuò)散池法、人工滲透膜和數(shù)學(xué)模型等，其中擴(kuò)散池試驗(yàn)是評(píng)估化合物經(jīng)皮通透性的最好的方法。
簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，擴(kuò)散池法就是將人或動(dòng)物的離體皮膚安裝在擴(kuò)散池上，定時(shí)取接收液，用適宜的分析方法測(cè)定有效成分的含量，計(jì)算透皮速率來(lái)評(píng)價(jià)化學(xué)物的滲透特性。擴(kuò)散池可分為靜態(tài)擴(kuò)散池和動(dòng)態(tài)擴(kuò)散池兩大類，OECD化學(xué)物透皮吸收的體外方法測(cè)試指南適用于這兩類擴(kuò)散池模型。
靜態(tài)擴(kuò)散池有Franz擴(kuò)散池和Valia-Chien擴(kuò)散池兩種，其中Franz擴(kuò)散池為垂直式擴(kuò)散池，即皮膚模型將擴(kuò)散裝置分為上下兩室（圖2），此種擴(kuò)散池最為常用。體外試驗(yàn)可參考GB/T 27818-2011《化學(xué)品 皮膚吸收 體外試驗(yàn)方法》。
化妝品透皮吸收試驗(yàn)應(yīng)該如何做？
參考GB/T 27818-2011《化學(xué)品 皮膚吸收 體外試驗(yàn)方法》。我們?yōu)橐粋€(gè)要做透皮吸收試驗(yàn)客戶，推薦了體外擴(kuò)散池法。
通常體外試驗(yàn)用的離體皮膚有動(dòng)物皮膚、離體人皮膚以及三維重組皮膚模型幾大類。不同種屬、品系的動(dòng)物，甚至同一動(dòng)物不同解剖部位的皮膚結(jié)構(gòu)均不相同，因此其皮膚通透性不同，各種屬動(dòng)物皮膚通透性順序?yàn)椋杭彝?gt;大鼠>豚鼠>小型豬>恒河猴>人。
我們?cè)诖罅炕瘖y品透皮吸收試驗(yàn)研究中，在這些不同的動(dòng)物皮膚中，豬皮膚的滲透性與人體皮膚最為接近，豬的皮膚厚度與人體皮膚厚度相似，且豬的體表面積大，可同時(shí)采集多個(gè)標(biāo)本。
豬角質(zhì)層含有與人體角質(zhì)層非常相似的蛋白質(zhì)成分，其可變纖維密度、細(xì)胞重疊區(qū)域、真皮層膠原纖維、纖維束的結(jié)構(gòu)、膠原纖維的厚度以及真皮層血管的數(shù)量、大小、分布都與人體皮膚十分相似，并且許多抗體在豬皮膚上也顯示出了與人體皮膚相似的免疫活性。因此我們制定的方案就是使用巴馬香豬的離體豬皮來(lái)進(jìn)行。
Franz擴(kuò)散池試驗(yàn)方案
1.實(shí)驗(yàn)耗材與試劑
1.1 儀器
紫外分光光度計(jì)；改進(jìn)Franz擴(kuò)散池（擴(kuò)散面積4.52 cm2，接受室體積13 mL）；超級(jí)恒溫水浴裝置及磁力攪拌器。
1.2 試劑
0.15%濃度RHC（重組膠原蛋白），PBS。
1.3 動(dòng)物
實(shí)驗(yàn)用小型乳豬（巴馬香豬，體重約7 kg）
2.實(shí)驗(yàn)方法與步驟
2.1離體豬皮的制備
巴馬香豬處死后立即用電動(dòng)剪毛刀剪去腹部皮膚毛，剝離去毛部位皮膚，去除皮下組織后用生理鹽水沖洗干凈，置于生理鹽水中浸泡約30 min，取出，用濾紙吸干，備用。
2.2 溶液的制備
2.2.1 對(duì)照品溶液的制備：精密稱取RHC對(duì)照品適量，置50 mL容量瓶中，加5 mL磷酸緩沖液進(jìn)行溶解，用水稀釋至刻度，搖勻，精密量取2mL，置100mL量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，制成每1mL中含0.2mg的溶液，即為對(duì)照品溶液（RHC濃度為0.2mg/mL）。
2.2.2 樣品溶液的制備（透皮性試驗(yàn)）：取出儲(chǔ)備豬皮，解凍，生理鹽水洗凈，將其夾在接受室和供給室之間，皮膚外層表皮朝向供給室，調(diào)整水溫系統(tǒng)溫度為32±1℃，攪拌速率為200 r/min，在接受室加入預(yù)溫32±1℃的PBS溶液，將氣泡全部排出，將豬皮內(nèi)層表面與接受液接觸，再將1mg /mL的RHC溶液注入供給室緊貼于豬皮表面，于0.5h、1h、2h、4h、12h后用注射器吸取接受液適量，孔徑為0.45m的濾膜進(jìn)行過(guò)濾，取濾液作為樣品溶液。
2.2.3 空白基質(zhì)液的制備：取空白基質(zhì)適量，加入至注入室，0.5h、1h、2h、4h、12h后分別取接收液適量，孔徑為0.45 m的濾膜進(jìn)行過(guò)濾，取濾液作為空白基質(zhì)液。
2.3 HPLC分析
分別取上述對(duì)照品溶液、樣品溶液、空白基質(zhì)液進(jìn)行HPLC測(cè)定，波長(zhǎng)范圍220 nm。
3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析
通過(guò)對(duì)比對(duì)照品溶液、樣品溶液、空白基質(zhì)液經(jīng)230 nm下HPLC檢測(cè)是否存在吸收峰，判斷重組膠原蛋白是否透過(guò)了皮膚。
以上便是化妝品透皮試驗(yàn)最為詳細(xì)的介紹。目前來(lái)講，體外擴(kuò)散池法以其諸多優(yōu)點(diǎn)仍是目前最常用的獲得化妝品功效成分經(jīng)皮釋放曲線，及其在不同皮膚結(jié)構(gòu)中分布情況的檢測(cè)方法。
當(dāng)然，除了該方法，類似膠帶粘貼技術(shù)也可以用來(lái)測(cè)定角質(zhì)層中化學(xué)物質(zhì)含量，不過(guò)雖然該方法能很好地反映涂抹受試物局部皮膚的透皮吸收情況，但是缺點(diǎn)就是對(duì)志愿者的皮膚屏障有損傷作用。
此外類似傅里葉變換衰減全反射紅外光譜法、共聚焦拉曼顯微鏡和熒光壽命顯微成像技術(shù)等無(wú)創(chuàng)、實(shí)時(shí)的檢測(cè)技術(shù)也在化妝品透皮吸收方面的應(yīng)用越來(lái)越廣泛，但是這些檢測(cè)設(shè)備通常較為昂貴，而且這些光譜測(cè)試方法對(duì)實(shí)驗(yàn)者要求較高，實(shí)驗(yàn)時(shí)一般要求測(cè)試部位長(zhǎng)時(shí)間保持不能移動(dòng)，具有一定挑戰(zhàn)性。
綜上所述，體外擴(kuò)散池法仍是化妝品透皮試驗(yàn)最好的選擇。
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